QuanNUA 核酸分型质谱的 10 种鸭源性致病病毒的快速检测，方法特异性良好

仪器与试剂

目标鸭源性病原体包括 DHAV-1 分离株 C80（DQ864514）、DHAV-3 分离株 C-GY（EU352805）、DAstV-1 分离株 D17（MN149392）、DAstV-2 分离株 SL4 （KF753806）、DRV-1 分离株 815-12（KC508656）、DRV-2 分离株 091（JX478256）、 TMUV 分离物 PS（KT876991）、GPV 分离物 JS1（KT935531）和 DEV 来自中国 农业大学兽医学院。AIV 亚型 H9N2（GQ373128）由中国农业大学禽流感实验室 提供。所有这些病毒在检测前均经 RT-PCR/PCR 鉴定。非靶标鸭源性病原菌包括 大肠杆菌、沙门氏菌和鸭疫里默氏菌，均来自中国农业大学兽医学院。2.5×PCR mix、质量探针试剂盒，以及 QuanTOF 质谱仪及 QuanNUA 软件，均来自于融智 生物科技（青岛）有限公司

实验方法

分别下载 10 种病毒的基因组序列，针对选定的靶基因，设计质粒构建用引物和检测用引物，分别构建了标准 质粒，建立检测方法，并确定检测方法的特异性；对标准质粒进行 10 倍系列稀释，确定该方法的敏感性。利用该 检测方法对人工制备的混合感染样品进行检测，与普通 PCR 检测结果进行比对。 结果与讨论 结果显示，本研究所建立的检测方法可同时检测到包括鸭甲肝病毒 1 型、鸭甲肝病毒 3 型、鸭星状病毒 1 型、 鸭星状病毒 2 型、鸭呼肠孤病毒 1 型、鸭呼肠孤病毒 2 型、坦布苏病毒、禽流感病毒、小鹅瘟病毒和鸭病毒性肠 炎病毒等 10 种病毒和 1 种内参基因，且 10 种病毒之间的检测结果互不干扰；对 10 倍系列稀释的标准质粒进行检测， 当稀释度为 10-10 时仍能检测到核酸，针对不同病毒的标准质粒最低检出量为 1.3~7.8 × 100 copies，对混合样 品的检测结果与普通 PCR 结果一致。

研究人员用已知含有特定病毒的临床样品模拟了四种混合感染，对该方法进行了评价。如预期的那样，在所 有的样本中，都能准确地识别出目的病毒，包括 RNA 和 DNA 病毒。

结果

综 上 所 述， 本 研 究 建 立 的 基 于 QuanNUA 核酸分型质谱的 10 种鸭源性致病病毒的快速检 测，方法特异性良好，与普通 PCR 相比，基于 QuanNUA 核酸分型质谱的检测方法的灵敏度大大 提高，并可对同一样品进行多种病毒的检测，使整 体检测成本下降，不同病毒之间的检测结果互不干 扰，可为鸭病毒病病原的快速诊断和分子流行病毒 学调查提供极大便利。基于核酸质谱的检测方法， 可实现对无法以核糖体蛋白作为生物标志物的微生 物进行检测，使 MALDI-TOF MS 有望成为对此类 微生物进行快速、高灵敏分型鉴定的新的有效工 具，具有一定的应用推广潜力。

参考文献

Establishment of a simultaneous detection method for ten duck viruses using MALDI-TOF mass spectrometry. Ning Liua,Lei Wanga,Gaozhe Caib,et al. [J].Journal of Virological Methods, 273 (2019) 113723.