近日，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所使用融智生物QuanSNP核酸质谱平台建立了肺炎支原体（MP）多位点SNP分型与大环内酯类抗生素（ML）耐药同时检测的方法。相关研究结果已经发表在iScience上，文章标题为“A multisite SNP genotyping and macrolide susceptibility gene method for Mycoplasma pneumoniae based on MALDI-TOF MS”（ https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102447）。文章的第一作者为赵飞研究员，通讯作者为肖迪研究员，融智生物作为合作单位参与其中。

 肺炎支原体（MP）是引起儿童及成人呼吸道感染的重要病原菌，每年约10%-30%的社区获得性肺炎病例由其感染引起。大环内酯类抗生素（ML）是临床MP感染治疗的一线药物，尤其在儿童中使用非常普遍。2000年以后，国际上ML耐药MP比例持续升高，中国MP的ML耐药率一直居高不下。MP的ML耐药与其23S rRNA基因突变密切相关，其中2063、2064突变与ML高水平耐药相关，2617突变与低水平耐药相关。因此，上述位点的基因检测成为可替代ML体外药敏实验，快速检测MP的ML耐药的技术。目前耐药基因检测最常用的方法有荧光PCR的高分辨率熔解曲线（HRMA）法、限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法和焦磷酸测序法。

基因分型是MP分子生物学与流行病学特征研究的重要手段。MP基因组高度保守，菌株间相似度高达99%，基于单核苷酸变异和基因插入缺失，肺炎支原体明确分为两种基因型。基于p1基因的PCR-RFLP分型、基于pl基因的VNTR分型以及基于MPN459/MPNA5864基因的荧光PCR技术是目前常用的MP基因分型技术。尽管操作相对简便，但靶位点单一导致区分能力有限，是此类方法的劣势。多位点的MLVA及MLST分型技术相继报道，有效提升了MP分型能力。然而，上述基因分型技术耗时且技术要求高，使其应用受到限制。如果再加上MP耐药基因检测，则MP基本分子生物学特征检测过程更加繁琐耗时，因此需要研发新型快速、低成本的分型与耐药检测技术。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术近年来被用于单位点核苷酸多态性（SNP）检测。其检测原理是，首先使用多重PCR扩增含SNP靶位点的目的基因；其次，通过特异性质量探针进行SNP位点延伸，最后通过MALDI-TOF MS鉴定不同质量探针分子量得到检测结果。

基于MALDI-TOF MS的SNP分型分析，在手足口病毒、HBV检测以及HPV分型等方向已经广泛应用，并且具有取代传统鉴定技术的潜力。基于MALDI-TOF MS的SNP分析方法具有高通量、快速、多靶标同时检测的优点，是当前最有应用前景的生物分子技术之一。

图1. 基于MALDI-TOF MS技术用于MP分型和耐药基因检测实验流程图（左）；

融智生物QuanSNP核酸质谱平台（右）

在该研究中，开发了一种基于多重PCR和MALDI-TOF MS方法同时检测MP的6个分型靶位点和3个ML耐药基因。该方法对20种非MP菌株核酸均未检测到质量探针延伸信号，表明该方法具有良好的特异性；肺炎支原体M129菌株用于检出限测试，该方法最低检出限为100拷贝/反应。使用141株临床MP菌株的核酸样本进行分型与耐药分析，QuanSNP检测结果与测序和药敏结果一致率100%，表明该方法具有很好的鉴定准确性。在30例MP阳性临床样本中，25例中检测到9个分型与耐药SNP位点，检测阳性率为83.3%，表明该方法具有良好的临床标本分型和耐药检测能力，适用于MP类生长缓慢病原体的快速分型与耐药检测。

图2-A 9个MPE质量探针的质谱图

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 图2-B 基于肺炎支原体菌株质量探针延伸后的质谱图

基于融智生物的QuanSNP核酸质谱平台，中国疾控中心传染病预防控制所开发了一种基于多重PCR和MALDI-TOF MS的方法，同时检测MP多位点分型以及ML耐药基因，该方法具有操作简便、特异性强、低成本以及高通量的优点。实现MP多位点SNP分型与ML耐药基因的同时检测，分型能力强且兼顾两型菌株，耐药位点检测全面且准确，适用临床标本检测。同时，核酸质谱平台可满足客户的不同检测需求，在微生物鉴定、分型以及耐药检测中具有良好的应用前景。